高分子量蛋白（大于150 kD）Western Blot攻略

高分子量蛋白（大于150 kD）Western Blot攻略

注：該文引自基因幫公眾號天才試劑君文章，略有修改。  Ver.730875

● 一 選對凝膠很重要

三種最常見(jiàn)的凝膠系統包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate系統。

Tris-Glycine凝膠的pH為8.6，且保質(zhì)期很短，一般4-8℃保存有效期一個(gè)月。在跑膠的過(guò)程中，凝膠系統的pH還有上升的趨勢，可達到9.5，這會(huì )導致蛋白降解和低分辨率。

Bis-Tris凝膠的pH為~6.5，相對Tris-Glycine凝膠，穩定性和保質(zhì)期都有所增加，4-8℃貯存可以保存一年。但這種凝膠更適合于低分子量電泳分離（低于200 kD），不適合高分子量蛋白電泳。

Tris-Acetate 凝膠的pH為~7，跑大分子蛋白會(huì )呈現很高的分辨率，同時(shí)4-8℃貯存可以保存一年。

所以跑大分子蛋白時(shí)，我們推薦使用Tris-Acetate 凝膠（貨號：RTD6162；RTD6155）。

● 二 凝膠濃度很重要

既然選擇了Tris-Acetate 凝膠，要考慮凝膠濃度的問(wèn)題。凝膠濃度與孔徑成反比：濃度越小，孔越大，較大的蛋白質(zhì)更容易通過(guò)較大的孔，所以建議使用低百分比的Tris醋酸凝膠（貨號：RTD6162），如6％等度膠。也可以使用梯度凝膠，但是制作梯度凝膠會(huì )恨棘手，需要一個(gè)梯度凝膠生成系統（貨號：RT-GZY02），不過(guò)現在很多公司都會(huì )出售具有不同范圍的梯度預制膠（貨號：RTD6155），節省時(shí)間。

● 三 電泳內槽緩沖液需要添加抗氧化劑

Tris-醋酸電泳使用10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液（貨號：TA050），經(jīng)典的Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液無(wú)法兼容使用。由于DTT在pH中性時(shí)，基本不隨著(zhù)樣品泳動(dòng)，為保證蛋白樣品在電泳中維持還原力，Tris-Acetate 凝膠電泳時(shí)，電泳槽內槽緩沖液需要添加抗氧化劑（貨號：TA1510），這樣可以保證整個(gè)電泳過(guò)程中蛋白的變性還原狀態(tài)，提高樣品的分辨率。

● 四 提高轉膜緩沖液中的SDS，減少甲醇

高分子量蛋白轉膜緩沖液中的組成至關(guān)重要。如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀，可以通過(guò)減少轉膜緩沖液中的甲醇百分比（10％或更低）來(lái)避免這種情況發(fā)生。為了進(jìn)一步確保蛋白質(zhì)不會(huì )沉淀，考慮在轉膜緩沖液中添加SDS至終濃度為0.05%-0.1％。SDS向蛋白添加均勻的負電荷，使得它們更容易從凝膠轉移到膜上。高分子量蛋白的轉膜緩沖液可以選擇10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（濕轉，粉末型）（貨號：TA5030P）

● 五 選擇合適的轉印膜

轉印膜一般有PVDF膜或NC膜，跑大分子蛋白建議選擇PVDF膜。如前面所說(shuō)，如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜可以不需要在轉膜緩沖液中添加甲醇，目的蛋白轉印的機會(huì )更高。PVDF膜有各種孔徑尺寸，最常見(jiàn)的是0.22 μm和0.45 μm。與凝膠一樣，較大的蛋白比較小的蛋白更容易穿過(guò)大孔隙。高分子量蛋白質(zhì)可以用0.45μm膜（貨號：ML-PV-131545-5）轉移，避免使用0.22 μm孔徑。

● 六 增加轉印時(shí)間

在正確的選擇完凝膠、轉印膜及轉移緩沖液后，轉印正式開(kāi)始。半干轉快且方便，但不適用于大分子蛋白。大分子蛋白建議濕轉，因為大分子蛋白轉移時(shí)間很慢，推薦350-400 mA轉移90 min或 4℃，40 mA，轉印過(guò)夜。

● 七 關(guān)于轉印膜封閉

沒(méi)有任何一種封閉試劑能通用于蛋白封閉。BSA通常作為NC膜的封閉液，但是對于PVDF膜，它的封閉效果并不是最好。大蛋白轉膜后的封閉可以選擇5%脫脂奶粉（貨號：WN1070）。

另外，不要讓PVDF膜在檢測過(guò)程中的任何時(shí)間點(diǎn)干透，如果膜部分變干，可以讓膜完全干掉，然后用甲醇重新潤濕，之后用緩沖液浸泡，繼續操作。