Hochest 33342即用型染色液
Hochest 33342 Stain
RTU Solution,10 μg/ml
● 產(chǎn)品組成：
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貨號
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名稱(chēng)
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規格
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貯存
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HE1013S
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Hochest
33342即用型染色液
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10
ml
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-20℃
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說(shuō)明書(shū)
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一份
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
Hoechst 33342，也稱(chēng)bisBenzimide
H 33342 或HOE 33342，分子式為C27H28N6O·3HCl
，分子量MW561.93，CAS:
23491-52-3，是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低。Hoechst
33342 專(zhuān)一性地與雙鏈DNA結合（優(yōu)先結合AT），常用于細胞核染色。染色后可以用熒光顯微鏡觀(guān)察或流式細胞儀檢測。Hoechst 33342 的最大激發(fā)波長(cháng)為346 nm（紫外激發(fā)），最大發(fā)射波長(cháng)為460nm（藍色熒光）；Hoechst 33342 和雙鏈DNA 結合后，最大激發(fā)波長(cháng)為350nm，最大發(fā)射波長(cháng)為461nm。另外，由于Hoechst 33342專(zhuān)一性結合DNA，不與RNA結合，樣品無(wú)需使用RNase處理。與DAPI相比，Hoechst
33342具有更好的膜通透性，更適合于活細胞的染色。
Hoechst 33342和Hoechst
33258相比，Hoechst 33342對細胞的毒性作用更小一些，33258穿透能力較33342弱，染活細胞時(shí)容易被"泵出"，也就是拒染。所以一般來(lái)說(shuō)Hoechst 33258用于細胞固定后再染色，而Hoechst33342則可以對活細胞直接進(jìn)行染色。
本染色液為即用型，濃度為10
μg/ml，可直接用于固定細胞或組織的細胞核染色，也可直接用于活細胞或組織的細胞核染色。
● 貯存：
-20℃避光保存，一年有效。
● 操作步驟：
一.固定后的細胞樣品染色：
1.1 貼壁細胞：
1.1.1 取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5分鐘或更長(cháng)時(shí)間，無(wú)菌超凈臺內吹干或用無(wú)菌的PBS洗滌三遍，再用細胞培養液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內，種入細胞培養過(guò)夜，生長(cháng)至50%-80%滿(mǎn)度。
1.1.2刺激細胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養液，加入0.5
ml固定液，固定10分鐘或更長(cháng)時(shí)間(可4℃過(guò)夜)。
1.1.3去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)。
1.1.4加入0.5
ml Hoechst 33342染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動(dòng)晃動(dòng)數次。
1.1.5去盡染色液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)。
1.1.6滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。
1.1.7 熒光顯微鏡使用紫外激發(fā)，可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長(cháng)350nm左右，發(fā)射波長(cháng)460nm左右。
注：熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡快檢測。
1.2懸浮細胞：
1.2.1 500 g（2400
rpm，下同）離心收集凋亡處理后細胞樣品于1.5 ml離心管內，加入0.5
ml固定液，緩緩懸起細胞，常溫固定10分鐘或更長(cháng)時(shí)間(可4℃過(guò)夜)。
1.2.2離心去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，洗滌期間手動(dòng)晃動(dòng)數次。
1.2.3 細胞沉淀中加入0.5
ml Hoechst 33342染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動(dòng)晃動(dòng)數次。
1.2.4 離心收集沉淀，重懸于100 μl PBS中。
1.2.5 取5 μl抗熒光淬滅封片液于載玻片上，加入等體積步驟1.2.4染色后細胞重懸液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。
1.2.6 熒光顯微鏡下紫外激發(fā)，可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長(cháng)350 nm左右，發(fā)射波長(cháng)460 nm左右。
注：熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡快檢測。
二.活細胞染色：
2.1 加入適當量Hoechst 33342染色液，必須充分覆蓋住待染色的樣品，通常對于六孔板一個(gè)孔需加入1 ml染色液，對于96孔板一個(gè)孔需加入100微升染色液。
2.2 在適宜于細胞培養的溫度下培養20-30分鐘。棄染色液，用PBS洗滌2-3次即可進(jìn)行熒光檢測。細胞發(fā)生凋亡時(shí)，在熒光顯微鏡下觀(guān)察會(huì )看到凋亡細胞的細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。
三. 實(shí)驗示例:
HeLa細胞染色圖。圖A為正常細胞Hoehst
33342的染色效果圖。圖B中除了正常細胞外，還清晰可見(jiàn)呈現致密濃染的凋亡細胞。
操作流程： Jurkat細胞，計數1×106/ml；500 g 3 min收集2 ml 細胞；細胞沉淀中加入1 ml卡諾固定液，常溫固定10 min；1×PBS漂洗兩次；細胞沉淀中加入200 μl Hoechst 33342即用型染色液（10 μg/ml）；37度避光染色10 min； 離心后細胞沉淀重懸于100 μl 1×PBS中；取5 μl細胞懸液滴于載玻片上，加5 μl 抗熒光淬滅劑，封片觀(guān)察。