半干轉轉印對濾紙要求較高，要用超厚濾紙，如伯樂(lè )厚度2.4mm濾紙（伯樂(lè )貨號：1703965）?；蛘哌x擇半干轉轉印濾布（貨號：SP1010）

5×RealBlot快速半干轉轉膜緩沖液（粉末型）

             5×RealBlot Fast Semi-Dry Transfer buffer（power）       

Ver750278-1.0

● 產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

5×RealBlot快速半干轉轉膜緩沖液使用獨特配方，使用半干轉法（Semi-dry blot）方法，能在10-20分鐘內高效快速地將蛋白轉移到印跡膜（PVDF膜或NC膜）上。

特點(diǎn)：

環(huán)境友好：快速轉膜液可以不使用甲醇，減輕了對實(shí)驗者和環(huán)境的傷害。

兼容性好：快速轉膜液能兼容Tris-甘氨酸膠，Bis-Tris膠等多種凝膠。

節省時(shí)間：快速轉膜液能在10-20分鐘內完成蛋白的轉印。

本產(chǎn)品為粉末型包裝，溶于水后可以配制500 ml 5×RealBlot快速半干轉轉膜緩沖液。以每次轉印使用100 ml 1×RealBlot快速半干轉轉膜緩沖液計算，該產(chǎn)品可以使用25次。

● 貯存、效期及運輸：

   常溫貯存；有效期3年；常溫運輸。

● 使用說(shuō)明：

轉膜前的準備：

半干轉轉印濾布（貨號：SP1010）或2張半干轉專(zhuān)用超厚濾紙（厚度2.4 mm）；裁好的轉印膜；足夠的1×RealBlot快速半干轉轉膜緩沖液；無(wú)水甲醇；無(wú)水乙醇。

1. 按照下表配制5×RealBlot快速半干轉轉膜緩沖液（溶液型）：

2. 按照下表配制1×RealBlot快速半干轉轉膜緩沖液：

注：2.1 按照順序加入各種溶液。如果加入轉膜液后不加水而是加入醇將會(huì )產(chǎn)生沉淀。

    2.2 配好的轉膜緩沖液4度預冷30-60分鐘再使用，將會(huì )大大降低轉膜時(shí)的發(fā)熱量。

3. 將濾布或濾紙浸泡在1×快速轉膜液中，完全浸濕3-5分鐘。

4. PVDF膜使用前要用無(wú)水甲醇潤濕30秒，浸泡在1×快速轉膜液中，平衡5分鐘。NC膜無(wú)需處理，直接浸泡在轉膜緩沖液中。

5. 將凝膠在超純水中浸泡漂洗2分鐘，去除膠表面的SDS。

6. 按照順序做好轉印三明治結構：

                                                                     圖二

6.1 排列順序（圖一）：1 負極（陰極）-2一張超厚濾紙或四層濾布-3 凝膠-4 轉印膜-5一張超厚濾紙或四層濾布-6 正極（陽(yáng)極）

6.2凝膠在轉印槽中的排列（圖二）：

一板膠盡量排布在轉印槽中間位置；兩板膠把小片段靠近（foot-to-foot）排布在轉印槽中間位置。

7. 用滾輪趕出氣泡。

8. 半干轉推薦使用恒流轉移：

●  實(shí)驗示例：

電泳：4-18%預制膠
電泳：1×TGS 200V 57-23mA 50min
濾紙：2.4mm厚濾紙（Bio-Rad 1703965）
轉印膜：0.22 NC膜（Cat：ML-NC-152022-5）
儀器：Turbo半干轉機器 恒流1.3A 10min
染色：膜麗春紅染色

● 常見(jiàn)問(wèn)題：

Q1.為什么轉膜后膠上還是有可見(jiàn)的預染Marker或考馬斯亮藍染后膠上有比較多的殘余蛋白？

A1：目前沒(méi)有任何一種轉膜方法可以做到100%完全把蛋白從凝膠轉移到膜上，轉移結束后凝膠上總是或多或少地殘留著(zhù)蛋白。一般說(shuō)來(lái)，快速半干轉可以比較完全地把預染Marker轉移到膜上，然而對目的蛋白轉移來(lái)說(shuō)，或多或少在膠上會(huì )有殘余。相對于低分子量蛋白來(lái)說(shuō)，高分子量蛋白在膠上的殘余會(huì )更加明顯。如果半干轉轉膜后發(fā)現預染Marker在膠上都明顯可見(jiàn)，說(shuō)明您需要優(yōu)化轉膜條件?？梢匝娱L(cháng)轉膜時(shí)間或/和使用甲醇配制轉膜緩沖液。我們的實(shí)驗結果發(fā)現，使用甲醇配制轉膜緩沖液至少可以提高20%的轉膜效率（圖三）。

圖三

Q2. 配制1×轉膜緩沖液時(shí)，可以使用甲醇代替乙醇嗎？

A2：可以使用甲醇代替乙醇，并且使用甲醇配制的轉膜緩沖液轉膜效率要高于乙醇（圖三）。然而，考慮到甲醇的毒性和環(huán)境的不友好，請謹慎選擇是否使用。

Q3. 轉膜緩沖液含有SDS嗎？

A3：轉膜緩沖液中含有SDS，SDS帶負電荷，可以有效提高轉移效率。

Q4. 轉膜結束后發(fā)現三明治溫度很高，有燒膠變黃的現象，應當如何避免？

A4：使用推薦的轉膜條件，基本可以避免燒膠現象。如果出現了燒膠現象，可以采用以下方案優(yōu)化。第一 提前將浸泡有厚濾紙（厚2.4 mm）或濾布的轉膜緩沖液4度預冷30-60分鐘。第二 盡量不要使用多層疊加放置的薄濾紙（一般濕轉用的濾紙厚度會(huì )低于1 mm），它們吸水和保水能力較弱，在高電流的轉膜條件下緩沖液很容易揮發(fā)殆盡，導致燒膠現象。第三 如果無(wú)奈使用多層薄濾紙進(jìn)行半干轉實(shí)驗，建議縮短轉膜時(shí)間，然而會(huì )導致轉膜效率降低，膠上殘余較多。

Q5. 5×RealBlot快速半干轉轉膜緩沖液能用于伯樂(lè )Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell嗎？

A5：伯樂(lè )的SD系統是老式半干轉系統，5×RealBlot快速半干轉轉膜緩沖液與其不兼容，不建議使用。

Q6. 5×RealBlot快速半干轉轉膜緩沖液適用于哪些半干轉機器？

A6. 目前已經(jīng)測試的機器列表如下：