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動(dòng)物線(xiàn)粒體提取試劑盒(細胞樣品)

動(dòng)物線(xiàn)粒體提取試劑盒(細胞樣品)

產(chǎn)品編號:RTD8115

產(chǎn)品規格:50次

數量
價(jià)格 ¥400

動(dòng)物線(xiàn)粒體提取試劑盒(細胞樣品)

          (Animal Cell Mitochondria Isolation Kit)     

產(chǎn)品貨號

名稱(chēng)

規格

RTD8115

動(dòng)物細胞線(xiàn)粒體提取試劑盒(細胞樣品)

50

 

 

 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

動(dòng)物細胞線(xiàn)粒體提取試劑盒(Animal Cell Mitochondria Isolation Kit)可以快速便捷分離培養細胞的線(xiàn)粒體。試劑盒的緩沖系統不含任何表面活性劑和螯合劑EDTA,分離獲得的線(xiàn)粒體純度較高,并且絕大部分分離獲得的線(xiàn)粒體都含有完整的內膜和外膜,可以用于線(xiàn)粒體的生理功能等方面的研究。另外,優(yōu)化的裂解配方配套離心柱法有效裂解細胞,省去了經(jīng)典方法使用玻璃勻漿器的繁瑣操作,更加省時(shí)省力。同時(shí),本試劑盒在分離線(xiàn)粒體的同時(shí)可以獲得去除線(xiàn)粒體的細胞胞漿蛋白,可以研究線(xiàn)粒體蛋白向胞漿內的運輸機制。

該產(chǎn)品約30分鐘即可完成培養細胞線(xiàn)粒體的提取。線(xiàn)粒體是在溫和、非變性條件下提取的,結合不同的溶解液,溶解后的線(xiàn)粒體可以用于SDS-PAGE變性電泳檢測、Blue Native非變性電泳檢測以及等電聚焦電泳等。另外,提取的線(xiàn)粒體具有生理功能,可以用于線(xiàn)粒體的生理功能等方面的研究。

按照每次提取2×107細胞計算,試劑盒可以使用大約50次。

產(chǎn)品組成

產(chǎn)品編號

名稱(chēng)

規格

貯存

RTD8115-01

分離緩沖液A

15 ml

-20℃

RTD8115-02

分離緩沖液B

15 ml

-20℃

RTD8115-03

漂洗緩沖液

30 ml

-20℃

RTD8115-04

貯存緩沖液

3 ml

-20℃

PS1020

變性蛋白溶解液

5 ml

RT

CD-50

離心柱套裝

(包含離心柱和2ml連蓋收集管)


50個(gè)

RT





 

說(shuō)明書(shū)

 

 

貯存條件和運輸:

按照標簽溫度貯存;有效期一年;濕冰運輸。

用前必讀:

1. 離心機請調整成RCF/g模式,按照離心力設置離心機(不要根據轉速rpm模式設置),所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機中進(jìn)行。

2. 將分離緩沖液A,分離緩沖液B,漂洗緩沖液和貯存緩沖液混勻后放置于冰上。將離心柱套入2 ml連蓋收集管中,蓋好管蓋,放置于冰上預冷。

3. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑(自備,試劑盒不提供),根據蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在膜蛋白提取溶液中(如抑制劑母液是 100×,添加時(shí)按照1:100添加,即1ml膜蛋白提取溶液添加10μl抑制劑)。研究蛋白磷酸化,需要添加磷酸酶抑制劑(自備,試劑盒不提供)。

4. 蛋白定量推薦使用BCA方法,可以選擇BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:RTP7102)。

使用方法:

. 準備溶液:

常溫溶解試劑盒中的各種溶液,溶解后立即置于冰上并混勻。如果最終實(shí)驗目的是制備線(xiàn)粒體蛋白樣品,根據樣品數量,取適量體積分離緩沖液A加入蛋白酶抑制劑。按照下表大體估算分離緩沖液A的使用體積:

細胞類(lèi)型

培養器皿

細胞數量

細胞沉淀體積(PCV)(μl

分離緩沖液Aμl

懸浮細胞

 

~2×107

~200

250

貼壁細胞

96孔板

~1×105

調整細胞數目到2×107

250

24孔板

~5×105

6孔板

~2.5×106

25cm2培養瓶

~2×106

75cm2培養瓶

~8×106

35 mm培養皿

~2×106

60 mm培養皿

~5×106

100 mm培養皿

~1.5×107

注:(二百萬(wàn),2×106)HeLa細胞,其細胞沉淀體積(PCV,Packed Cell Volume)大約為20 μl。

. 收集細胞:

2.1 對于貼壁細胞:細胞用PBS漂洗一遍,棄PBS;再加入適量PBS,用細胞刮刀刮下細胞,或用0.02% EDTA(0.5 mM)溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊,并用移液器吹打下細胞。400 g(~2000 rpm) 4℃離心5 min收集細胞,盡最大努力吸盡上清,留下細胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細胞,以免胰酶降解需提取的目的蛋白。

2.2 對于懸浮細胞:400 g(~2000 rpm)4℃離心5 min收集細胞,用PBS洗一遍,離心收集細胞,盡最大努力吸盡上清,留下細胞沉淀備用。

. 裂解細胞膜:

3.1細胞沉淀中加入250 μl準備好的分離緩沖液A(含蛋白酶抑制劑),用移液器吹打重懸細胞沉淀,渦旋劇烈震蕩30-60,冰浴處理10分鐘,間歇2-3混勻。

注:建議將起始細胞數不要低于2×107,否則將導致最后線(xiàn)粒體得率過(guò)低。

3.2 將細胞懸液轉移到離心柱中,蓋上管蓋,16,000 g(~13000 rpm) 4℃離心1分鐘,離心后收集管底部會(huì )有沉淀形成。

     注:離心柱最大體積為600 μl;確保離心機可以在10秒內達到16000 g。

3.3 棄去離心柱,蓋好2 ml收集管管蓋,用1ml移液器輕柔吹打重懸收集管中的沉淀。

. 去除細胞核和未破碎的細胞:

溶液700 g(~2700 rpm) 4℃離心1分鐘,用200 μl吸頭小心將上清(上清稍有渾濁)轉移到新的1.5 ml離心管中。注意:轉速不要超過(guò)700g,否則會(huì )降低線(xiàn)粒體的得率。

關(guān)鍵步驟:吸取上清時(shí)不要觸及沉淀,甚至可以丟棄部分上清不吸取,以免上清(含線(xiàn)粒體)中污染核蛋白。如果使用250 μl分離緩沖液A,建議吸取200 μl上清。此步驟得到的細胞核純度不高,混雜有沒(méi)有完全破碎的完整細胞,不建議用于相關(guān)實(shí)驗。

. 收集線(xiàn)粒體:

5.1 上清中加入等體積的分離緩沖液B(如步驟4吸取200 μl上清,則加入200 μl分離緩沖液B),混勻;

5.2 16000 g(~13000 rpm) 4℃離心10分鐘,用200 μl吸頭吸去上清,沉淀即為提取的線(xiàn)粒體。上清是胞漿蛋白,如需要可保存備用。

關(guān)鍵步驟:此步驟必須完全將上清吸取干凈,可以用200μl吸頭分次吸取上清,最后用10 μl吸頭將殘余上清徹底吸凈,以免線(xiàn)粒體中污染胞漿蛋白。

. 線(xiàn)粒體漂洗:

   線(xiàn)粒體沉淀中加入0.5 ml 漂洗緩沖液,輕柔重懸沉淀,16,000 g,4℃離心5分鐘,棄上清,沉淀即為漂洗后的線(xiàn)粒體。

. 線(xiàn)粒體的使用:

7.1 線(xiàn)粒體功能研究:

如果用于完整線(xiàn)粒體的功能或酶活性研究,初始2×107細胞分離得到的線(xiàn)粒體樣品中加入100-150 μl線(xiàn)粒體貯存緩沖液,重懸線(xiàn)粒體后-80℃備用。不建議長(cháng)期貯存,盡快使用。

7.2 線(xiàn)粒體蛋白電泳:

7.2.1線(xiàn)粒體蛋白變性樣品處理:

7.2.1.1 初始2×107細胞分離得到的線(xiàn)粒體沉淀中建議使用50 μl變性蛋白溶解液(貨號:PS1020)溶解線(xiàn)粒體沉淀;

7.2.1.2 BCA方法測定蛋白濃度(貨號:RTP7102);

7.2.1.3用變性蛋白溶解液調整蛋白濃度為1 μg/μl,按需分裝,每管50 μl,-80℃保存待用;

7.2.1.4取一管50 μl樣品加入SDS-PAGE上樣緩沖液(貨號:PL080,PL113,PL121)處理,建議調整上樣液濃度為0.5 μg/μl;對于多次跨膜蛋白(Multi-pass membrane protein)的變性電泳檢測,樣品建議使用37℃處理30分鐘,不要95℃加熱5分鐘,因為在95℃高溫情況下,多次跨膜蛋白極易聚集形成多聚體,樣品會(huì )聚集,WB檢測會(huì )表現為比實(shí)際蛋白大小更大的分子量;

7.2.1.5 使用SDS-PAGE凝膠(貨號:RTD6132,RTD6116)電泳,每個(gè)泳道上樣10-40 μl(5-20 μg)。

7.2.2 線(xiàn)粒體蛋白BN非變性樣品處理:

7.2.2.1 初始2×107細胞分離得到的線(xiàn)粒體沉淀中建議使用50 μl膜蛋白重懸液(BN電泳用)(貨號:PN1020)重懸線(xiàn)粒體沉淀;

7.2.2.2 BCA方法測定蛋白濃度(貨號:RTP7102);

7.2.2.3 用膜蛋白重懸液(BN電泳用)(貨號:PN1020)調整蛋白濃度為1 μg/μl,按需分裝,每管50 μl,-80℃保存待用;

7.2.2.4 取一管50 μl樣品,溶化混勻后4℃ 16000 g 5分鐘,去除上清,保留沉淀;

7.2.2.5 沉淀中加入50 μl膜蛋白增溶液A(貨號:DM1080),輕柔重懸沉淀,盡量不產(chǎn)生氣泡,冰浴10分鐘;

7.2.2.6 4℃ 16000 g 15分鐘,取上清至一干凈1.5 ml離心管中即為增溶后線(xiàn)粒體蛋白溶液(小心不要吸取沉淀),此時(shí)得到的線(xiàn)粒體蛋白濃度為1 μg/μl,其中去垢劑DDM(n-Dodecyl β-D-maltoside,β-DM, n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷)終濃度為1%;

7.2.2.7 線(xiàn)粒體蛋白溶液中加入1/10體積10×膜蛋白A型上樣緩沖液(配套膜蛋白增溶液A使用)(貨號:PL130),使用BN凝膠電泳(貨號:RTD6139,RTD6140),每個(gè)泳道上樣5-20 μg。

7.2.3 線(xiàn)粒體蛋白等電聚焦樣品處理(2D凝膠第一維電泳):

建議線(xiàn)粒體沉淀中使用溶解液:7 M尿素,2 M硫脲, 2%CHAPS,20 mM DTT(自備,試劑盒不提供)。

線(xiàn)粒體產(chǎn)量和質(zhì)量的評價(jià):

8.1 線(xiàn)粒體產(chǎn)量:

細胞系

細胞數量

線(xiàn)粒體蛋白

K562

2×107

100-150 μg

Jurkat

2×107

80-100 μg

Hela

2×107

100-150 μg

NIH-3T3

2×107

80-120 μg

8.2 線(xiàn)粒體質(zhì)量評價(jià):

線(xiàn)粒體質(zhì)量評價(jià)首先看提取的線(xiàn)粒體是否具有完整的內外膜結構(進(jìn)行線(xiàn)粒體功能活性研究),其次要看裂解后的線(xiàn)粒體蛋白是否有明顯的富集,其三要看裂解后的線(xiàn)粒體蛋白是否有其他組分交叉污染,最后看提取的線(xiàn)粒體中是否可以檢測出目的蛋白。使用專(zhuān)門(mén)的線(xiàn)粒體內參檢測(下表),可以初步確認提出的是線(xiàn)粒體蛋白。線(xiàn)粒體蛋白是否有效富集需要用總蛋白作為對照,與總蛋白相比,線(xiàn)粒體內參蛋白是否有明顯富集。線(xiàn)粒體蛋白中的交叉污染可以用其他組分內參檢測線(xiàn)粒體蛋白樣品,如關(guān)注線(xiàn)粒體蛋白中是否有胞漿蛋白污染,可以使用胞漿蛋白內參檢測線(xiàn)粒體蛋白,檢測條帶的強弱即說(shuō)明線(xiàn)粒體蛋白與胞漿蛋白交叉污染的程度。用目標蛋白抗體檢測線(xiàn)粒體蛋白,驗證是否可以檢測到目的蛋白,蛋白大小是否符合預期。

位置

內參名稱(chēng)

大小 kD

細胞膜

Na-K ATPase

100

內質(zhì)網(wǎng)膜

Calnexin

~90

線(xiàn)粒體膜

COX IV

17

許多研究人員利用 WB對分離的線(xiàn)粒體蛋白進(jìn)行純度檢測,經(jīng)常發(fā)現一些常用的胞漿內參能在線(xiàn)粒體蛋白中檢測到,例如β-actin[1], GAPDH [2]β-tubulin,這是由于這些胞漿內參不僅存在于胞漿也存在于線(xiàn)粒體中,因此可以在線(xiàn)粒體蛋白中檢測到胞漿內參。更多信息,請參閱以下論文:

1 Hatch, Anna L., Pinar S. Gurel, and Henry N. Higgs. Novel roles for actin in mitochondrial fission. Journal of Cell Science (2014) 127, 1–12

2 Zhang, Jin-Ying, et al. Critical protein GAPDH and its regulatory mechanisms in cancer cells. Cancer Biol Med 2015;12:10-22.

實(shí)驗示例:

不同去垢劑處理K562細胞線(xiàn)粒體3-12%BN電泳


 
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